|
當臨床醫師懷疑病人患有微生物引起的感染性疾病時，常常要做病原學檢驗。方法之一是取患處分泌物或組織，制成標本或涂片，經染色或不染色，在顯微鏡下查找病原微生物。結核杆菌、真菌孢子、寄生蟲等較大的微生物均可采用這種方法檢驗。衣原體和病毒顆粒一般小於0.2 μm，我們不能在光學顯微鏡下分辨出來，要經特殊處理，在電子顯微鏡下觀察它們的特征。支原體小於細菌又大於病毒，那麼，能否將病人患處分泌物制成涂片，在相差光學顯微鏡下加上電子放大，將圖像放大後，在顯視屏幕上直接觀察活的支原體個體，做出病原學診斷呢？要回答這個問題，要從三方面分析：
支原體的形態特征
支原體是沒有胞壁的原核微生物，由於缺乏胞壁，菌體有一定可塑性，形態呈多形性變化。由於寄宿細胞或體外培養條件不同，繁殖期不同，菌體大小和形態也各異。在體外適宜培養條件下，菌體通常呈細絲狀、螺旋絲狀或球菌狀等。菌體大小、形態也與支原體種類和生長狀況等有密切關系。螺旋絲狀菌體的直徑為（0.08?0.2）μm，長度為（2?5）μm，由於其直徑小於光學顯微鏡分辨力，雖然有長度，但在相差顯微鏡下不能觀察到菌體；細絲狀菌體的直徑為（0.2?0.4）μm，長度可達100 μm；球菌體橫徑為0.3 μm，長徑為（0.3?0.8）μm，雖然球菌體的個體大於顯微鏡分辨力，但在相差顯微鏡下，僅可粗略地觀察到菌體輪廓，不能分辨菌體的微細結構以及與寄宿細胞之間的結構關系。另外，患處分泌物混雜著局部組織或細胞的變性、退變及崩解產物。因此，僅僅從球菌體的粗略形態或菌體與細胞黏附狀況，不能確診為支原體。因為采用這種方法既可出現假陰性，也可出現假陽性。其診斷的可靠性值得懷疑。
光學顯微鏡的有效
放大倍數
光學顯微鏡是依據可見光線透過介質後發生折射的原理，使物體放大到人眼可清晰見到的物體。由於光的波動性和顯微鏡各項技術參數如亮度、反差等因素的限定，目前，高檔顯微鏡的有效分辨力遵循以下公式：
有效分辨力=0.61×照明光線波長(λ)÷物鏡數值孔徑(NA)。
相差顯微鏡常用單一波長綠色濾片，波長為550 nm，高檔油浸相差NA為1.25，其最高有效分辨力為0.27 μm。
顯微鏡的有效放大倍數=NA×1000
按此公式可計算出，相差顯微鏡的最大有效放大倍數是1250倍，超過有效放大倍數為無效放大。其結果是，所觀察到物體雖然圖像很大，但細節分辨不清，形成大而模糊的圖像。另外，相差顯微鏡在觀察透明的相位物體時，被觀察物體與介質間形成『暈光環』，使在觀察菌體時，降低了菌體表面的清晰度。再者，由於支原體小，又無胞壁，使得菌體的光程差小。
相位物體的光程差(δ)=物體折射率(n)×物體厚度(e)。
菌體的光程差小，使菌體與介質間及菌體內結構間產生的明暗反差小，因而降低了有效分辨力。無論用暗相差或亮相差物鏡均會出現上述現象。
電子攝像
放大技術的效果
電子攝影放大技術是將光學顯微鏡復式放大的虛像圖像，再利用高分辨力的冷卻液晶顯示屏（CCD）攝像頭，通過視頻采集(或圖像掃描)，將攝取的圖像經電子放大十幾至幾十倍，在顯視屏幕上得到總放大倍數為原菌體幾千至幾萬倍的圖像。首先要明確地是，經光學顯微鏡放大的菌體虛像，再經電子放大不論多少倍，仍屬無效放大，因為它並沒有提高光學顯微鏡的有效分辨力，實際形成的圖像仍為大而不清晰的模糊圖像。通過電子視頻放大，可以提高被觀察菌體的明暗亮度反差，因而提高了一些清晰度。目前冷卻CCD攝像頭在1/2英寸上由150萬個像素組成圖像，一般顯視屏圖像可達580萬個像素組成，即可將原攝取圖像輸出放大4倍。圖像雖放大，但仍沒有提高對物體的分辨力。
綜合以上三點分析，可以了解到，用相差顯微鏡附加視頻放大，用來做臨床支原體病原學診斷，是不適宜的，其結論也值得懷疑。
|
